INTRODUCCIÓN

El estado de Guanajuato es el segundo productor de sorgo en el país, con 159,694 ha sembradas en seis regiones y una producción estimada de 886,206.99 t, como lo establece el Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Guanajuato (CESAVEG, 2015). La región Centro representa 71.5% de la superficie total sembrada en el estado de Guanajuato. La presencia de áfidos reduce los rendimientos en la producción de sorgo (Blackman & Eastop, 2000). El CESAVEG (2015) reportó incidencias de 42.09% en la producción del grano en el estado. El control de esta plaga es importante, ya que puede dañar toda la producción debido a la pérdida de savia como daño directo y el cúmulo de mielecilla sobre las hojas (Singh, Padmaja, & Seetharam, 2004) o la potencial transmisión de enfermedades virales (Rott, Mirkov, Schenck, & Girard, 2007), como daño indirecto

El método más utilizado para el control del pulgón amarillo es la aplicación de productos químicos, los cuales en ocasiones son ineficientes y pueden afectar negativamente a sus enemigos naturales (Rodríguez-del-Bosque & Terán, 2015). Este método está basado en el uso de materias activas como imidacloprid, sulfoxaflor, spirotetramat, thiamethoxan y metamidofos. Aunque su uso puede controlar esta plaga, el uso recomendado de aplicaciones cada 20 días promueve la resistencia a los productos químicos en las poblaciones de insectos.

Está demostrado que la resistencia se debe al incremento de la actividad metabólica de la plaga. Estos mecanismos de resistencia metabólica no están ligados a ningún punto de acción específico trabajando en diferentes estructuras químicas de la molécula insecticida (grupos carboxilo, metil, ester, etc.) y, por tanto, pueden conferir resistencia a insecticidas de más de un grupo de diferente modo de acción. Las principales enzimas que se encuentran realizando estos mecanismos son esterasas, mono-oxigenasas, citocromo P450, y glutatión s-transferasas.

Los insectos resistentes pueden tener elevados niveles de una enzima en particular o formas alteradas de la que metaboliza al plaguicida a un nivel más rápido que la forma no alterada, como lo indica la Organización de las Naciones Unidas Para la Agricultura y la Alimentación (FAO, 2012). Sin embargo, la mayor parte de mecanismos de resistencia en común la constituye la resistencia metabólica, con con un aumento en las actividades de esterasas, glutatión-S-transferasas, acetilcolinesterasa y oxidasas (Bass & Field, 2011; Li,

Se sabe que las esterasas están implicadas en resistencia a organofosforados, carbamatos y piretroides debida a mutaciones puntuales, duplicaciones genéticas, regulación de la expresión, a una combinación de los tres mecanismos (Li et al., 2007) y a los insecticidas como reguladores del crecimiento de insectos (IGR), imidacloprid o toxinas de Bacillus thuringiensis (Oakeshott, Claudianos, Campbell, Newcomb, & Russell, 2005). Para el caso de glutatión S-tranferasas se cree que están implicadas en la resistencia a varias clases de insecticidas, incluyendo organoclorados, organofosforados y piretroides (Vontas, Small, & Hemingway, 2001), además se ha asociado como uno de los mecanismos de resistencia a los insecticidas carbamatos.

Por otro lado, Bisset (2002) menciona que las oxidasas están implicadas como el factor principal en muchos casos de resistencia metabólica a carbamatos y también detoxifican insecticidas organofosforados, mientras que la acetilcolinesterasa produce un amplio espectro de resistencia a la mayoría de los organofosforados y en mayor medida a los carbamatos. Se puede mencionar que en la región productora del centro del estado de Guanajuato se realizan hasta seis aplicaciones de insecticida por temporada de diferentes grupos químicos, por lo que se espera que dentro de las poblaciones exista una sobrexpresión de alguna de las enzimas detoxificantes antes mencionadas como responsable de la resistencia a insecticidas.

El objetivo de esta investigación fue cuantificar los niveles enzimáticos detoxificativos del pulgón amarillo que inducen resistencia a insecticidas sintéticos en las regiones productoras de sorgo en la región centro del estado de Guanajuato.

MATERIALES Y MéTODOS

Se identificaron parcelas de sorgo invadidas de pulgón amarillo en los municipios de Abasolo, Cuerámaro, Huanímaro, Irapuato, León, Manuel Doblado, Pénjamo, Purísima del Rincón, Romita, Salamanca, San Francisco del Rincón, Silao y Valle de Santiago, municipios pertenecientes a la región centro del estado de Guanajuato durante el ciclo primavera-verano 2017. En cada municipio se obtuvieron cinco muestras de diferentes localidades; estos consistieron en llenar un tubo Eppendorf de 1.5 ml con adultos ápteros, colocarlos en hieleras para evitar su deshidratación y trasladarlos al laboratorio de toxicología del Departamento de Parasitología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, donde se realizó la identificación según las características señaladas en la Guía ilustrada para la identificación de los pulgones (Hemíptera: Aphididae) de cereales de México, realizada por Peña Martínez et al. (2017).

Se almacenaron a una temperatura de -20

Se almacenaron a una temperatura de -20°C hasta obtener la cuantificación de enzimas detoxificativas. Para conocer la cantidad de pulgones o tejido a utilizar, se empleó la metodología descrita por Hernández-Bautista, Arredondo-Pérez, Cerna-Chávez, Ochoa-Fuentes y Navarro-Campos (2016), donde se reportó la cantidad comprendida en µg/ml de proteína encontrada en el rango de 80 a 120 µg/ml, como de 15 insectos. Una vez calculada la cantidad de insectos a emplear, se determinaron los niveles de α-esterasas (α-est), β-esterasas (βest), oxidasas (Oxid), acetilcolinesterasas (ACH) y glutatión S-transferasas (GST) utilizando las metodologías descritas por Brogdon (1988), Brogdon y Barber (1990) y Brogdon, McAllister y Vulule (1997).

Niveles enzimáticos

Para la determinación de alfa (α) y beta (β) esterasas en cada pozo de una microplaca se colocaron 100µl de homogenato, se agregaron 100 µl de acetato de alfa o beta-naftil (Sigma-Cas 830-81-9), se dejó incubar por 10 min, se agregaron 100 µl de fast-blue, se volvió a incubar durante 2 min a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia en el lector de placas usando un filtro de 540 nm. En cuanto a las oxidasas, se colocaron 100 µl de homogenato, se agregaron 200 µl de TMZ (Tetramethyl-Benzidina Di-hydrochloride) (Sigma- Cas 54827-17-7), agregando una gota de 25 µl de agua oxigenada (H2O2); se dejó incubar 5 min y se leyeron con un filtro de 620 nm. Para las GST se colocaron 100 µl de homogenato, se agregaron 100 µl de L- glutathion Reduced (Sigma- Cas 70-18-8), y 100 µl de CDNB (1 – cloro- 2,4 dinitrobenceno) (Sigma- Cas 97-00-7), se leyó inmediatamente que fue tiempo cero (T0) usando un filtro de 340 nm; se volvió a leer transcurridos 5 min (T5).

Para el análisis de resultados se sacó la diferencia entre ambos tiempos (T5-T0) y los resultados negativos se consideraron como cero. Por último, para ACH se colocaron 100 µl de homogenato, se agregaron 100 µl de acetilcolina-yodisada (Sigma- Cas 2260- 50-6) y 100 µl de DNTB (Ácido-Ditio-Bis-Nitrobenozoico) (Sigma- Cas 69-783); se leyeron en tiempo cero (T0) usando un filtro de 414 nm; transcurridos 10 min (T10) se volvió a leer. Para el análisis de resultados se obtuvo la diferencia entre ambos tiempos (T10-T0) y los resultados negativos se consideraron como cero.

Se estableció una proporción de resistencia con las absorbancias de cada enzima, se realizó una distribución de frecuencias y según el modelo de Montella et al. (2007) con pequeñas modificaciones, tomando como base los percentiles de todas las muestras y absorbancias, de cada una de las enzimas (dependiendo del tipo de enzima), para las α-esterasas los valores fueron >0.6000 escala 1, >0.8000 escala 2, >1.0000 escala 3, >1.2000 escala 4 y <1.25 escala 5. Para las enzimas β -esterasas fueron >0.8000 escala 1, >0.9000 escala 2, >1.0000 escala 3, >1.2000 escala 4 y <1.25 escala 5. Para las oxidasas fueron >0.2000 escala 1, >0.2500 escala 2, >0.3000 escala 3, >0.4000 escala 4 y >0.5000 escala 5.

Para la acetilcolinesterasa los valores fueron >0.0050 escala 1, >0.0150 escala 2, >0.0300 escala 3, >0.0400 escala 4 y >0.0600 escala 5. Finalmente, para las glutatión S-transferasa fueron >0.0130 escala 1, >0.0200 escala 2, >0.0300 escala 3, >0.0400 escala 4 y >0.0600 escala 5 (1: proporción nula; 2: ligera; 3: moderada; 4: alta y 5: muy alta). Por último, se realizó un ANOVA, cuando indicó que había diferencia significativa entre los tratamientos se aplicó la prueba de Tukey (P= 0.05), para la comparación de las medias, utilizando el programa estadístico R versión 3.3.1. Se utilizó el método UPGMA (media aritmética no ponderada) para calcular las distancias de la presencia de enzimas y generar los grupos más compactos y homogéneos y así diferenciar los grupos de enzimas dentro de las poblaciones.

Este método es eficiente, ya que genera conglomerados equilibrados y de tamaño pequeño, además de que tiene interpretación sencilla (Peña Martínez et al., 2017); para este método se utilizó el programa Statistic (versión 6.0) en la generación de dendrogramas. El criterio tomado para la distancia de corte y definición de grupos en su realización fue establecido sobre el número óptimo de grupos cuando se produjeron saltos bruscos en las distancias.

RESULTADOS

Para los niveles enzimáticos (tabla 1), las α–est en el municipio de Silao presentaron el mayor valor con 1.0641, seguido de Irapuato y Huanímaro con medias de 1.0556 y 1.0159, respectivamente; de acuerdo con la clasificación de resistencia de Montella et al. (2007), estos tres municipios presentaron los valores de resistencia alta y no fueron significativamente diferentes entre sí. Por otra parte, la localidad de León presenta un promedio de 0.5768, que de acuerdo con la escala de clasificación se encuentra en el nivel 1, que es nula.

Para el caso de las β-est, los municipios de Salamanca e Irapuato presentaron una detoxificación muy alta en la escala de Montella et al. (2007) y un valor promedio de 1.2612 y 1.2418, respectivamente. Caso contrario con los municipios de Valle de Santiago, que obtuvo un promedio de 0.8984, seguido de Pénjamo, con valor de 0.8729 y Abasolo, León, Manuel Doblado y Silao con 0.8322, 0.8134, 0.8121 y 0.7822, respectivamente, con un valor 2 en la clasifi- cación de resistencia, que es ligera

En cuanto a la enzima GST, los municipios de Pénjamo y Salamanca presentan resistencia moderada, con valores de 0.0257 y 0.0235, respectivamente. Lo contrario fue para Irapuato con 0.0119, Huanímaro con 0.0115 y San Francisco del Rincón, Valle de Santiago, Abasolo y Purísima del Rincón con 0.0111, 0.0051, 0.0040 y 0.0038, respectivamente, con valor 1 en la escala de clasificación de resistencia, correspondiente a nula.

Los municipios de Abasolo, Romita y Silao observaron los mayores valores para la enzima ACH, con 0.0217, 0.0186 y 0.0172, respectivamente, con valor de 3 en la escala de clasificación de resistencia, que corresponde a moderada. El caso contrario fue Salamanca, que reportó 0.0049, en cuanto a la clasificación de resistencia 1, que es nula (tabla 1). Para el caso de las oxidasas, Salamanca y Abasolo presentaron los valores más altos con 3 en la escala de resistencia, que corresponde a moderada, con 0.3268 y 0.3172, respectivamente. Por otra parte, Pénjamo, Irapuato, Huanímaro y Cuerámaro, fueron los municipios que con los valores más bajos (0.2489, 0.2534, 0.2475 y 0.2286) presentaron resistencia 1, que corresponde a nula.

El municipio de Salamanca obtuvo los mayores valores para las enzimas en estudio, además es el municipio en el que mayor superficie de sorgo se siembra, con 19,588 ha, que corresponde a 12% de toda la superficie sembrada en el estado y con la que se han obtenido rendimientos de 6.58 t/ha de acuerdo con el SIAP (2017). En comunicación personal con técnicos de MasAgro Guanajuato, mencionan que en este lugar se tiene alta tecnología en producción de sorgo y que los productores realizan de tres a cuatro aplicaciones de insecticidas para el control de pulgón amarillo.

En la figura 1 se observa que se formaron tres grupos principales de las 13 poblaciones. El primero constituido por enzimas GST y ACH, las que se observaron estrechamente relacionadas, lo que indica que en las poblaciones en estudio, estas no juegan un papel importante en la detoxificación de insecticidas, ya que presentaron promedios desde 0.0112 hasta 0.0137. El segundo grupo lo integraron GST, ACH y oxidasas con valores desde 0.0112 hasta 0.2734. El tercero estuvo conformado por las enzimas α–est y β-est, con valores de 0.8430 a 0.9699, respectivamente, lo cual indica que la detoxificación a insecticidas en Melanaphis sacchari en la región centro del estado de Guanajuato está relacionada con la alta actividad de α–est y β-est.

En la tabla 2 se muestra la variabilidad total observada en las 13 poblaciones de M. sacchari con base en la determinación de las enzimas α–est, β-est, GST, ACH, oxidasas, los dos factores explicaron el porcentaje de 62.8%. El factor 1 con 39.13% (tabla 2) presentó una mejor agrupación con respecto a las demás con 0.0090, donde los municipios que presentaron una mayor agrupación a la enzima fueron Purísima del Rincón con 0.0108, Romita con -0.0410 y Valle de Santiago con -0.0037, que presentaron asociación negativa (figura 2). El factor 2 (23.67%) (tabla 2) estuvo determinado con asociación entre los municipios de Abasolo y Pénjamo, que obtuvieron valores de 0.0794 y 0.1450, respectivamente, para la enzima ACH.

Se observa que las enzimas que tuvieron una mejor agrupación fueron ACH con asociación positiva de 0.0090, en agrupación con GST de -0.0078 y oxidasas de -0.0222, con coalición negativa. Los municipios que se encuentran en el círculo de estas enzimas son Abasolo (0.0744), Huanímaro (0.2390), Pénjamo (0.1450) y Purísima del Rincón (0.0108), con agrupación positiva. En caso contrario estuvieron Cuerámaro (-0.0146), Romita (-0.0410) y Valle de Santiago (-0.0037), con asociación negativa. Los resultados muestran la diversidad en la presencia enzimatica de M. sacchari en los 13 municipios muestreados correspondientes a la región centro del estado de Guanajuato.

DISCUSIÓN

Las α–est en los municipios de Silao, Irapuato y Huanímaro presentaron los valores más altos, que de acuerdo con la clasificación de proporción de resistencia se clasifica como alta. Estos valores son similares con los reportados por Flores et al. (2006) en un trabajo con mosquitos de Aedes aegypti L., los cuales mostraron niveles enzimáticos elevados característicos de los mecanismos de resistencia de α–est en poblaciones que se han expuesto a piretroides y organofosforados.

Para el caso de las β-est, en Salamanca (figura 3) e Irapuato clasificaron en la categoría muy alta. Estos valores concuerdan con los reportados por Criniti et al. (2008), quienes reportaron que diferentes poblaciones de Myzuspersicae tienen una elevada producción de esterasas, las cuales secuestran y detoxifican insecticidas con grupos estéricos. De igual manera, Ponce-Garcia, Badii, Roberto y Flores (2009) dedujeron que las β-est son el mecanismo que registra los valores más altos en adultos de Aedes albopictus (Skuse) expuestos a piretroides y organoclorados.

En cuanto a la enzima GST, las plantas de Pénjamo y Salamanca presentaron una resistencia moderada, el resto nula. Estos valores tienen similitud con los reportados por Rodríguez, Bisset, Molina, Díaz y Soca (2001) en cepas de A. Aegypti, donde se muestra que la frecuencia de aparición del mecanismo GST es muy baja. Lo atribuyen a que este mecanismo de detoxificación interviene generalmente en la resistencia a organofosforados, pero en las cepas estudiadas el mecanismo de esterasas elevadas fue el de mayor frecuencia en estas poblaciones y principal responsable de la resistencia a organofosforados.

Para la ACH, en los cultivos de Abasolo, Romita y Silao se clasificaron en escala 3, que corresponde a resistencia moderada. Al respecto, Bisset (2002) menciona que este mecanismo produce un amplio espectro de resistencia a insecticidas organofosforados y, en mayor medida, a carbamatos. En cuanto a las oxidasas, los cultivos de Salamanca y Abasolo clasifican como resistencia moderada. El resto de municipios presentan resistencia nula. Al respecto, Guerra Pimentel, D'Antonino Faroni, Duarte Batista y Da Silva (2008) mencionan que las oxidasas juegan un papel fundamental en la detoxificación de diversos plaguicidas, participan directamente en la inhabilitación del producto u oxidándolo para que entren otros sistemas enzimáticos y puedan ser detoxificados. Según Clark, Scott, Campos y Bloom-quist (1995), las enzimas oxidativas son el principal mecanismo fisiológico de resistencia a la abamectina (figura 4).

En la figura 1 se observa que se formaron tres grupos principales: el primero con GST y ACH, con valores más bajos (0.0112 a 0.0137); el segundo con GST, ACH y oxidasas, con valores intermedios; mientras que el tercero por α–est y β-est, con puntajes más altos. Lo anterior indica que la detoxificación a insecticidas en M. sacchari en la región centro del estado de Guanajuato está relacionada con la alta actividad de las enzimas α–est y β-est, esto posiblemente se deba a las aplicaciones de insecticidas organofosforados y carbamatos. Pasteur y Raymound (1996) reportaron que estas dos enzimas son idóneas en la resistencia, a través de la detoxificación a estos grupos químicos. Por otro lado, Brogdon y Barber (1990) y Flores et al. (2006) reportaron que estas enzimas juegan un papel en la detoxificación o resistencia a piretroides.

CONCLUSIONES

Se observó que los municipios más sobresalientes para α-est fueron Huanímaro, Irapuato y Silao, los cuales reportaron resistencia alta; mientras que para β-est, Salamanca e Irapuato reportaron resistencia muy alta en comparación con los demás municipios, por lo que se propone reducir las aplicaciones de organofosforados y carbamatos debido a que estas enzimas son las responsables de su detoxificación. Para el caso de oxidasas, las plantas de Salamanca y Abasolo obtuvieron una resistencia moderada. Pénjamo y Salamanca sobresalieron para GST, mientras que Abasolo, Romita y Silao para ACE, las cuales se encontraron en resistencia moderada. Es posible establecer que el principal mecanismo detoxificador presente en las poblaciones del pulgón amarillo son las α y β esterasas.

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Notas de autor

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